ICS 65.020.30 B 44 中国实验动物学会团体标准 实验动物

T/CALAS 101-2021 东方田鼠遗传质量控制
Laboratory animal —Genetic quality control of Microtus fortis 2022-01-10 发布 中国实验动物学会 2022-01-10 实施 发布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草 规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国实验动物学会归口。 本文件由全国实验动物标准化技术委员会（ SAC/TC281 ）技术审查。 本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。 本文件起草单位：上海实验动物研究中心、上海市农业科学院畜牧兽医研究所、上海 市计划生育科学研究所实验动物经营部。 本文件主要起草人：倪丽菊、高骏、谢建芸、柏熊。 全国团体标准信息平台 实验动物 东方田鼠遗传质量控制 1 范围 本文件规定了封闭群东方田鼠的命名、繁殖方法、遗传质量监测方法、遗传信息档案 的管理。 本文件适用于封闭群东方田鼠的遗传质量控制。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日 期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 14923 《实验动物 哺乳类实验动物的遗传质量控制》 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 封闭群东方田鼠 closed colony of Microtus fortis 经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或来源清楚， 用于科学研究、教学、生产、检定及其他科学实验的东方田鼠，以非近亲交配方式进行繁 殖生产，在不从外部引入新个体的条件下，连续繁殖 4代及以上的种群。 4 封闭群东方田鼠命名 由2～4个大写英文字母命名， 种群名称前标明保持者的英文缩写名称， 第一个字母应 大写，后面的字母小写，一般不超过 4个字母。保持者与种群名称之间用冒号分开。 5 封闭群东方田鼠的繁殖方法 按GB 14923 中4.2的规定执行。 6 封闭群东方田鼠的遗传质量监测 6.1 封闭群东方田鼠的遗传质量标准 封闭群东方田鼠应符合以下要求。 a）具有明确的遗传背景，来源清楚，有完整的资料（包括种群名称、来源、遗传特性 及主要生物学特征等）。 b）用于封闭群保种及生产的繁殖记录卡应清楚完整，繁殖方法科学合理。 全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）
22 c）经遗传检测（微卫星 DNA 标记检测方法）质量合格。 6.2 封闭群东方田鼠遗传检测方法及实施 6.2.1 抽样 按表 1要求从每个封闭群中随机抽取东方田鼠，雌雄各半。 表1 封闭群东方田鼠遗传检测的抽样要求 群体数量 抽样数量 100只及以下 ≥16只 100只以上 ≥30只 6.2.2 检测方法 采用微卫星 DNA 标记检测方法，具体方法参见附录 A。 6.2.3 结果判定 群体内遗传变异采用平均观测杂合度和平均期望杂合度指标或群体在各位点的平衡 状态进行评价。当平均观测杂合度和平均期望杂合度在 0.5～0.7时，群体为合格的封闭 群东方田鼠群体。对各位点在群体内的等位基因进行哈迪 -温伯格平衡（ Hardy-Weinberg equilibrium ）检测，如群体在某些位点偏离平衡状态，应加强繁殖管理，避免近交。 6.2.4 检测间隔时间 封闭群东方田鼠每年至少进行一次遗传质量检测。 7 封闭群东方田鼠遗传信息档案的管理 a） 封闭群东方田鼠的遗传信息档案应包含种群名称、 来源、 每年遗传监测抽样的动物 个体编号、微卫星位点名称及其相对应的个体的基因型。 b） 分析不同世代获得的基因频率和基因型频率的差异， 及时调整保种方案以保存种群 的遗传多样性，避免近交系数的上升。 c） 一般由专人进行遗传信息档案的记录和保管， 除纸制材料外， 应注意电子档案的录 入和备份。 全国团体标准信息平台 23 实验动物 东方田鼠遗传质量控制 附 录 A （规范性附录） 封闭群东方田鼠微卫星 DNA 标记检测方法 A.1 基因组 DNA 提取 从东方田鼠眼眶采集抗凝血 200 µL 或剪取 0.5 cm 东方田鼠尾巴，用常规酚氯仿抽提 法或试剂盒提取基因组 DNA ，测量基因组 DNA 的浓度与纯度， OD 260/OD 280应在 1.7～1.9。 将DNA 溶液的浓度调整至 20 ng/µL ，20℃保存备用。 A.2 微卫星位点及引物信息 用18个东方田鼠微卫星位点检测封闭群东方田鼠的遗传概貌。 各微卫星位点上游 PCR 引 物的 5′进行荧光染料标记，根据各位点的目的片段长度、引物的荧光标记和退火温度的不同， 将所有引物分为 7个组合，同组内的微卫星位点可以同时扩增检测。具体引物信息见表 A.1。 表A.1 东方田鼠 18个微卫星位点的引物信息 组合 位点编号 引物序列及荧光标记 5′→3′ 等位基因范围 /bp 等位基因 个数 退火温度 /℃ Panel 1 MFBAC67-34 FAM-AAGCAGAGGACAGTAATGG 116 ～156 20 54 CCTTGAACTTGGAGAATGAC MFA53 HEX-CCAGTGTATTACTGCATCTAAGC 147 ～175 14 AGGCTGTAAGGGACCAAGT MFB41 FAM-GACCATAAAGTGAGATGCTACC 209 ～245 15 AGTGCTGGGATTAAAACG Panel 2 MFBAC133-32 HEXATCGCCAGAATCTACATCC 192 ～210 9 58 CCAAGTGACAGTGAGAGG MFA50 FAM-CCACTGGAGATATGAGGTGATCGT 128 ～154 13 GGTGAATGGGAGGTGAAGAGTTTG MFBAC52-05 HEX-CTCCA GTTCCAGTCAGAG 265 ～293 13 AAGGTCAATCTTGGTGGTT Panel 3 MFA56 HEX-CTGTCTTCTGACCTCCAAAC 119 ～155 15 58 TCTCCCTTCACTAAACCATG MFA300 FAM-GGAGACTTACATACAGACCAAACA 284 ～310 10 GGGGAACAAACCCAGGAC MFA178 HEX-ATGTCCTATTTGGGGCTGAG 177 ～205 15 CTGAAAACCGGGAAGGCT Panel 4 MFA73 HEX-CATGTGTTTCCTGGTGACTC 136 ～164 15 59 TCTCCAAGTCTCCTGCTCCT MFBAC114-22 FAM-CAGGCTATCCATGCTCTC 373 ～427 17 CGGTGACAATTCTCCTAGCAG 全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）
24 续表 组合 位点编号 引物序列及荧光标记 5′→3′ 等位基因范围 /bp 等位基因 个数 退火温度 /℃ Panel 4 MFBAC107-05 HEX-TAGTGAAGCCAACAACCAAAAT 230 ～258 8 59 CAAGGAAGTGAGAGGAACAT Panel 5 MFA257 FAM-CTTGGTCCGCAGTAGAGTC 96 ～138 21 57 GGTCATCAGGTTGGCTTG MFA184 FAM-CGCCTCACAGATTCTTACC 210 ～260 17 TCTTCCCAGGAGACCCTA MFA313 FAM-AAGCAGGAATCAAACAGC 266 ～296 15 TGGGTGTGCCTATAATCTCAG Panel 6 MFA356 FAM-GCACAATGAAGAGCCTAAG 105 ～159 18 56 GAAGCCTTATACAGACTCCT MFBAC57-07 HEX-AGCCTCAACAGATTCTAGGAC 176 ～202 13 CACACTATTGGCAGTCTCT Panel 7 MFA247 HEX-CACAACACCCAGGAGGAG 301 ～341 15 57 ACTATGAGTTAGCAGGACGAC A.3 PCR A.3.1 PCR 反应体系和程序 采用多重 PCR 扩增试剂盒进行 PCR 实验。 PCR 反应总体积为 12.5 µL ，其中 10×Multi HotStart PCR Buffer 1.