ICS 71.100.70 C2682 Y42 团 体 标 准 T/SHRH 0 17-2019 _________________________________________________________________________________________ 化妆品防腐挑战试验 Antimicrobial Effectiveness Testing of Cosmetics 2019-03-22发布 2019-04-01实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………………………… 2 1.范围………………………………………………………………………………………… 3 2.规范性引用文件 …………………………………………………………………… ……… 3 3.生物安全措施和防污染措施 …………………………………………………………… … 3 4.术语和定义 ………………………………………………… ………………… …………… 3 5.仪器和设备 …………………………… ………… ………………………… ……………… 4 6.试剂和材料…………………………………………………………………………… …… 4 7.操作步骤 ……………………………………………………………………………… …… 5 8.结果判断 …………………………………………………………………………… ……… 5 附录A 培养基和试剂 ………………………………………………………………………… 7 附录B常见中和剂参考表 …………………………………………………… ……………… 9 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 上海海关 食品中心、上海家化联合股份有限公司、 上海东晟源日化有限公司、 上 海天祥质量技术服务有限公司、上海轻工业研究所有限公司 、上海日用化学品行业协会 。 本标准主要起 草人：刘夏、李晓虹、王传现、 曹平、陈园园、陈田、谢坤、王革 、李琼、陈逸君 、 金坚、陈亦华 3 化妆品防腐挑战试验 1 范围 本部分规定了 化妆品防腐性能的检测评价方法 。 本部分适用于 液体类、乳液类、膏霜类等 常见化妆品 的防腐体系 性能测试，其他 产品也可根据用途 选择采用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 化妆品安全技术规范（ 2015版） 消毒技术规范（ 2002版） GB/T 6682 -2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 -2008 实验室生物安全通用要求 GB4789.28 -2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 3 生物安全措施和防污染措施 3.1 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物和废弃物应参照 GB 19489中的有关规定执行。 3.2 防污染措施 防止污染措施应符合 GB/T 27403 的规定。 4 术语和定义 4.1 防腐挑战试验 即微生物 挑战性实验：将一定量的微生物加入到化妆品中，模拟化妆品中可能出现的污染情况，每 隔一定时间对其中的活菌量进行检测，以活菌增减量判断化妆品防腐体系效能的实验方法。 4.2 中和剂（ neutralizer ） 在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与杀菌剂的混悬液中和微生物表面上残留的杀菌剂，使 其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。 4.3 中和产物（ product of neutralization ） 指中和剂与杀菌剂作用后的产物。 5 仪器和设备 5.1 水浴锅： 48℃±2 ℃。 5.2 移液器：量程 0.5 µ L~10 µ L ；量程 10 µ L~100 µL；量程 100 µ L~1000 µ L 及无菌吸头。 5.3 无菌吸管， 10.0 mL（具 0.1 mL刻度）或移液器及吸头 。 5.4 离心机： 2000 g； 5.5 显微镜； 5.6 三角瓶（ 200m L）； 5.7 玻璃试管（ 18 mm×180mm）； 5.8 恒温培养箱： 32.5 ℃± 2.5 ℃ 22.5 ℃± 2.5 ℃。 5.9 电子天平。 5.10 生物安全柜。 4 5.11 计时器。 5.12 比浊仪。 5.13 涡旋振荡器。 6 试剂和材料 除另有规定外，所有 试剂均为 分析纯或生化试剂。 6.1 实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 6.2 磷酸盐缓冲液（ PBS）： 0.03 mmol/L ，pH 8.0，见附录 A.1。 6.3 营养琼脂培养基：见附录 A.2。 6.4 沙氏琼脂培养基 （SDA）：见附录 A.3。。 6.5 Eugon LT 100 肉汤：见附录 A.4。 6.6 D/E中和肉汤（ Dey/Engley 中和肉汤） :见附录 A.5。 6.7 改良 Letheen肉汤：见附录 A.6。 6.8 胰蛋白胨大豆琼脂（ TSA）：见附录 A.7。 6.9 试验菌株：金黄色葡萄球菌（ ATCC 6538 ） 、大肠埃希氏菌 （ ATCC 25922 ） 、 铜绿假单胞菌 （ ATCC 15442）、白色假丝酵母菌（ ATCC 10231 ）、黑曲霉菌 （ATCC16404 ）。 7 操作步骤 7.1 菌液制备 7.1.1白色假丝酵母菌菌液的制备：从保存好的试管斜面上（或菌种保存管中）取适量的菌体或菌种吸 附小磁珠接种于沙氏葡萄糖琼脂斜面， 28 ℃±2 ℃，培养 18-24 h。用接种环取第 1代培养物，划线接 种于 SDA平板， 28 ℃±2 ℃，培养 18-24 h。挑取上述第 2代培养物中典型菌落，划线接种于 SDA琼 脂斜面， 28 ℃±2 ℃，培养 18-24 h，即为第 3代培养物。吸取适量的无菌 PBS缓冲液加入斜面试管内， 反复吹洗， 洗下菌苔。 将洗液转移至另一无菌试管中， 涡旋混匀 20 s。用PBS缓冲液将其稀释成约 1.0106 cfu/mL ~1.0107 cfu/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在 2 h内使用，或在 2 ℃~8 ℃保存不超过 24 h。 7.1.2铜绿假单胞菌 \金黄色葡萄球菌 \大肠杆菌菌液的制备：从保存好的试管斜面上（或菌种保存管中） 取适量的菌体或菌种吸附小磁珠接种于胰蛋白胨大豆琼脂斜面， 36 ℃± 1 ℃，培养 18-24 h。用接种环 取第 1代培养物，划线接种于 TSA平板， 36 ℃± 1 ℃ ℃，培养 18-24 h。挑取上述第 2代培养物中典 型菌落，划线接种于 TSA琼脂斜面， 36 ℃± 1 ℃ ℃，培养 18-24 h，即为第 3代培养物。吸取适量的 无菌生理盐水加入斜面试管内，反复吹洗，洗下菌苔。将洗液转移至另一无菌试管中，涡旋混匀 20 s。 用无菌生理盐水将其稀释成约 1.0107 cfu/m ~1.0108 cfu/mL L的菌悬液。制备好的菌悬液应在 2 h内 使用，或在 2 ℃~8 ℃保存不超过 24 h。 7.1.3黑曲霉孢子悬液的制备：从保存好的试管斜面上（或菌种保存管中）取适量的菌体或菌种吸附小 磁珠接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面， 22.5 ℃± 2.5 ℃，培养 7 d-11 d。吸取适量的无菌 0.05%(v/v) 吐温 80生理盐水加入斜面试管内，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中。将孢子悬液转移至装有玻璃珠的无菌三 角瓶中，轻轻振摇 1 min后，用无菌玻璃棉过滤除去菌丝。过滤后，显微镜下（ 400倍）观察悬液中是 否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 2000 g，离心 20 min除去菌丝。再次在显微镜下观察，若仍 有菌丝存在，需再次离心。用无菌 0.05%(v/v) 吐温 80生理盐水将其稀释成约 1.0106 cfu/mL ~1.0 107 cfu/mL的孢子悬液。制备好的孢子悬液应当天使用；或在 2 ℃~8 ℃保存不超过 2 d，使用前混合均匀 并在显微镜下观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则弃之不用。 7.2 中和剂鉴定试验 7.2.1 每种试验菌株的中和剂鉴定试验应分别进行。 7.2.2化学中和剂的选择：为了中和化妆品中的防腐剂，多采用 D/E中和肉汤、 Eugon LT 100 液体培养基 或者改良 LETHEEN肉汤。若中和效果不理想，可根据产品中添加的防腐剂类型，参考附录 B进行选择。 7.2.3 化学中和剂鉴定流程 7.2.3.1 将7.1中准备的菌液 10倍系列稀释至浓度为 1103 cfu/mL的菌悬液，用于中和鉴定试验。 5 7.2.3.2 将