ICS 65.020.30 B 41 团 体 标 准 T/CAAA 028—2019 兔病毒性出血症 2 型诊断技术规程 Code of practice of diagnostic techniques for rabbit hemorrha gic disease type 2 2019-01-21 发布 2019-01-21 实施 中国畜牧业协会 发布 T/CAAA 028-2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由中国畜牧业协会提出并归口。 本标准主要起草单位：江苏省农业科学院兽医研究所、青岛康大兔业发展有限公司、贵州福斯 特生物科技有限公司 本标准主要起草人：王芳、宋艳华、魏后军、胡波、范志宇、薛家宾、陈萌萌、仇汝龙、李明 勇、许俊才。 T/CAAA 028-2019 兔病毒性出血症2 型诊断技术规程 1 范围 本标准规定了兔病毒性出血症 2型的诊断技术要求。 本标准适用于兔病毒性出血症 2型的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 农医发[2017]25 号 病死及病害动物无害化处理技术规范 NY/T 541-2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 572-2016 兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法 NY/T 2960-2016 兔病毒性出血病病毒 RT-PCR检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 兔病毒性出血症 2 型 rabbit he morrhagic dis ease type 2 由杯状病毒科、兔病毒属兔出血症病毒 2型（ RHDV2）引起的家兔和野兔的高度传染性、急性 致死性疫病。 4 诊断技术 4.1 流行病学特点 4.1.1 易感动物 15日龄以上的家兔和野兔。 4.1.2 传染源 感染了 RHDV2的家兔和野兔。 4.1.3 传播途径 4.1.3.1 直接传播 通过其排泄物、分泌物、内脏器官、血液、兔毛等污染饮水、饲料、用具、笼具、空气，引起 易感兔发病和疫病流行。 4.1.3.2 间接传播 通过人、昆虫、鼠、其它畜禽等媒介，可长距离传播，引起易感兔发病和疫病流行。 4.2 临床症状和病理学变化 4.2.1 临床症状 1T/CAAA 028-2019 具有高度传染性和致死率，感染兔的死亡率为 5%～70%，潜伏期为 1d～ 3d，兔常在体温升高后 12h～36h 死亡。 4.2.2 病理学变化 以实质器官出血、淤血为主要特征。 4.3 实验室检验 4.3.1 病原学诊断 4.3.1.1 样本采集、保存和运输 样本采集、保存和运输按 NY/T 541-2016 的规定执行，病死兔按农医发[2017]25 号的规定执行。 4.3.1.2 红细胞凝集试验（HA） 红细胞凝集试验按 NY/T 572-2016 的规定执行， HA效价≥1:160 者判定为阳性。具体操作参见 附录 A。 4.3.1.3 核酸识别技术—RT-PCR 方法 核酸识别技术—RT-PCR 方法按 NY/T 2960-2016 的规定进行，检测样品出现与阳性对照相同的 目的条带，而阴性对照、空白对照无相应的目的条带的判定为阳性。具体操作见附录 B。 4.3.1.4 免疫印迹 免疫印迹具体操作见附录 C，NC膜上阳性对照出现大小约 60kDa的一条特异性条带，阴性对 照无相应条带；检测样品的泳道出现大小约 60kDa的一条特异性条带，判定为阳性。 4.3.2 血清学检测 4.3.2.1 红细胞凝集抑制试验（HI） 红细胞凝集抑制试验按 NY/T 572-2016 的规定进行，具体操作见附录 D，当兔血清 HI≥1:8，判 定血清样品为 RHDV2抗体阳性。 4.3.2.2 竞争 ELISA 竞争 ELISA 具体操作见附录 E，相对参考值（稀释 1/10阴性对照） ，血清第一个稀释度（1/10 ） 的光吸收值降幅＜15% 时，判定为阴性； 光吸收值降幅≥25% 时， 判定为阳性； 光吸收值降幅为 15%～ 25%时，判定为可疑。 4.4 结果判定 4.4.1 疑似RHDV2 感染引起的RHD 应符合 4.1和4.2的要求。 4.4.2 确诊RHDV2 感染引起的RHD 应符合 4.4.1和4.3.1.2且符合 4.3.1.3或者 4.3.1.4的要求。 2 T/CAAA 028-2019 附录 A (规范性附录) 红细胞凝集试验（HA） A.1 材料 A.1.1 试剂及反应板 1% 人“O”型红细胞悬液、U 型微量凝集板。 A.1.2 样品 待检兔肝脏、阳性对照 RHD2病死兔肝脏（或 RHDV2重组 VP60蛋白） 、阴性对照 健康兔肝。 A.2 方法 A.2.1 1%“O”型红细胞悬液的制备 取人“O” 型红细胞以 20倍量 PBS（0.01mol/L ，pH值7.0～ 7.2）混匀洗涤红细胞，以 400g离心 5min，弃上清，重复洗涤 4次，最后一次离心前，记录红细胞 的体积（在离心后扣减弃去上清液的体积，即为红细胞的体积) 。洗涤后的红细胞用 PBS配成 1%悬 液，置 2℃～ 8℃备用。 A.2.2 肝脏悬液的制备 取兔肝脏，剪碎，按 1:10加入 PBS后匀浆，反复冻融 3次，再以 1000g 离心 30 min，取上清液备用。 A.2.3 RHDV2 重组VP60蛋白的制备 将重组 2型兔出血症病毒 VP60杆状病毒接种 Sf9昆虫细胞， 5日后，收集细胞培养物，反复冻融 3次后，以 1000g离心 5min，取上清即为 RHDV2重组 VP60 蛋白，置 2℃～ 8℃备用。 A.2.4 红细胞凝集试验（HA）试验操作 a) 在U型微量凝集板上，从第 2孔至第 10孔，每孔加入 25µL PBS ； b) 在第 1、2孔加入 1:10的待检兔肝悬液 25µL； c) 从第 2孔开始，充分混合后用 25µL移液器等量倍比稀释至第 10孔，稀释后第 10孔弃去 25µL； d) 第11孔加入 RHD2病死兔肝脏悬液（或 RHDV2重组 VP60蛋白）25µL 作为阳性对照，第 12孔加入健康兔肝脏悬液 25µL为阴性对照； e) 每孔各加 1%人 “O” 型红细胞 25µL， 立即置于微型振荡器上摇匀， 于 2℃～ 8℃冰箱静置 45min， 待阴性对照孔中红细胞完全沉积后观察结果。 A.3 结果判定和红细胞凝集效价表示方法 a)“+ + + +”符号为 100%凝集，无红细胞沉积； b)“+ + +”符号为 75%以上凝集，有少于 25% 的红细胞沉积； c)“+ +”符号为 50%～75%凝集，有少于 50%的红细胞沉积； d)“+”符号为凝集的红细胞少于 50%，沉积的红细胞多于 50%； e)“–”符号为 100%的红细胞沉积。 RHD2病死兔肝脏悬液阳性对照或 RHDV2重组 VP60蛋白应出现“+ + + +”100% 凝集，无红 细胞沉积；被检样品出现“+ +”的最高稀释度作为其凝集价，凝集价≥1:160（即第 5孔)的判定为 阳性，如在（1:20）～（ 1:80）之间，判定为可疑，应进行重复试验，重复后仍为可疑的判定为阳性。 3T/CAAA 028-2019 附录 B (规范性附录) 核酸识别技术—RT-PCR 方法 B.1 材料 B.1.1 引物 上游引物：5 ′- ACTACTAGCGTGGTCACCACC-3 ′； 下游引物：5 ′- TTGTTATAAACGCTCAGGACCAAC-3 ′。 B.1.2 样本 待检兔肝脏、阳性对照 RHD2病死兔肝脏、阴性对照无特定病原体（SPF ）兔肝脏。 B.2 方法 B.2.1 肝脏样本 RNA 的提取 D E P C 水按 1:10加入组织中，研磨成悬液，装入用 DEPC处理过的 1.5mL EP 管中， 于-20 ℃反复冻融三次， 在高速冷冻离心机上， 以 7200r/min 离心 20min，取上清 200µL， 加入 Trizol 800µL ，振荡混匀后，室温放置 10min，加入氯仿 210µL，剧烈振荡后，室温放置 1min， 以4℃ 10000r/min 离心 15min，取上层水相 750µL，加入 0.5mL异丙醇，混匀，-20 ℃放置 15min， 以4℃ 10000r/min 离心 10min，去上清，缓缓加入 75%乙醇 1mL洗涤，以 4℃ 8000r/min 离心 5min， 去上清，室温干燥 20min，加入 DEPC水10µL，使充分溶解。或者按 RNA抽提试剂盒的方法进行。 B.2.2 RT-PCR B.2.2.1 反转录反应： 10×Buffer 2μL、10mm