ICS11.100 T/CSBT008—2019 可经输血传播感染病原体核酸筛查 技术要求 Requirementsfornucleicacidscreeningtechnologyfortransfusiontransmitted pathogens 2019-04-12发布 2019-04-12实施 中国输血协会发布T/CSBT 中国输血协会团体标准I目  次 前言.....................................................................................................................................................................II 1范围.................................................................................................................................................................1 2规范性引用文件.............................................................................................................................................1 3术语和定义.....................................................................................................................................................1 4影响检测结果的关键因素.............................................................................................................................2 5核酸检测试剂性能.........................................................................................................................................3 6试剂批质检.....................................................................................................................................................4 7应用常见问题.................................................................................................................................................5 附录A（规范性附录）分析灵敏度建立的基本方案...................................................................................7 参考文献...............................................................................................................................................................9II前  言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中国输血协会输血传播疾病专业委员会提出。 本标准起草单位：北京医院、北京市红十字血液中心、河北省血液中心、广州血液中心、深圳市血 液中心。 本标准主要起草人:王露楠、常乐、葛红卫、王素玲、郑优荣、曾劲峰、黄力勤、郑欣。1可经输血传播感染病原体核酸筛查技术要求 1范围 本标准规定了可经输血传播感染病原体核酸筛查技术的关键影响因素和性能验证要求，包括核酸筛 查试剂的性能要求以及应用中常见问题分析。核酸筛查方法包含聚合酶链反应（PCR）技术与转录介导 扩增（TMA）技术。本标准适用于核酸筛查试剂的验证评价及日常检测的质量控制。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 EP17-A2EvaluationofDetectionCapabilityforClinicalLaboratoryMeasurementProcedures;Approved Guideline—SecondEdition 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1聚合酶链反应polymerasechainreaction，PCR 一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。在特异性核酸模板、引物、DNA聚合酶、dNTP 等必要条件存在时，通过变性、退火、延伸不同温度变化的重复循环，使模板片段扩增放大数百万倍。 3.2转录介导扩增技术transcription-mediatedamplification，TMA 一种目的核酸的等温扩增方法，使用RNA转录（RNA聚合酶）和DNA合成（反转录），按照目标核 酸序列产生RNA扩增子。RNA和DNA都可以使用TMA方法扩增。 3.3信噪比signal-to-noiseratio,SNRorS/N 核酸检测过程中，目的核酸的靶信号与背景噪音信号的比值。通常PCR反应的信噪比在2-5:1时，可 以将靶信号与背景信号区分开。 3.4分析灵敏度analyticalsensitivity 检测系统或方法可检测的最低分析物浓度。在核酸检测中，分析灵敏度常用检出限（LoD）表示。 3.5检出限limitofdetection，LoD 样本中可被检测到的分析物的最低浓度。 注1：也被称为“最低检出限”或“最小可检出浓度（剂量或量值）”，有时也代表“分析灵敏度”； 注2：分析物可被稳定检出（通常在常规实验条件下，>=95%的样本）的最低浓度。23.6分析特异性analyticalspecificity 在定性检测中，分析特异性是指检测方法检测出特定核酸分子的能力。分析特异性通常取决于检测 系统的抗干扰能力。 4影响检测结果的关键因素 4.1核酸纯化方法 对核酸纯化方法的评估应考虑以下几个因素：每一步骤试剂残留对结果的影响，提取过程发生污染 的风险，提取反应的体积，样本混合过程的影响，样本提取过程是否有分管提取最后合并的步骤，操作 过程中溶液是否有气泡产生（是否有表面活性剂），是否有高温加热步骤，设备移液的准确性，移液步 骤是否有滴液的现象。 4.2引物探针的设计和验证 因为引物的设计是产品研发过程的一个重要环节，上市后不能随意变更，产品使用者只能对产品的 引物和探针的设计是否合理进行验证。对于PCR反应体系，验证主要参数包括扩增效率，常见亚型的检 出能力，检出限时的信噪比。对于TMA反应体系，验证参数主要包括不同浓度的信噪比，常见亚型的检 出能力。 4.3反应抑制物和干扰物 核酸扩增的效率有赖于酶的活性和离子浓度等条件。影响核酸扩增检测效率（包括逆转录效率）的 因素包括内源性的，即样本本身有抑制物；同时也包括外源性的，例如采血管里的某些成分、纯化过程 中引入的鳌合剂、表面活性剂、有机溶剂等。此外样本裂解纯化方法设计不合理或操作不当，也有可能 造成在样本提取过程中核酸的降解，从而导致假阴性的结果。 4.3.1内源性抑制因素 内源性抑制物是指样本本身含有的可以抑制核酸扩增过程中酶活性，降低扩增效率的物质。 在血液样本中最常见的是血清或血浆中人基因组DNA、血红素及其代谢产物，因此在启用核酸检测 系统前，应对不同溶血程度的溶血样本对检测的干扰进行评估。 4.3.2外源性抑制因素 外源性抑制因素主要来自于两个途径：一是采血管；二是提取纯化过程。 采血管不能采用肝素作为抗凝剂，因为肝素是DNA聚合酶的抑制剂；但采用EDTA抗凝的采血管时， 应考虑到EDTA有鳌合反应体系中的锰离子和镁离子的作用，同时采血管可能还有其他干扰反应的成分或 采血管材料可能会对病原体有吸附作用，应该在做检测系统的确认时，对采血管的适用性做出评估。 纯化过程有可能引入的包括试剂EDTA、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)、异硫氰酸胍和盐酸胍以及 一些有机溶剂，核酸纯化如果不能有效去除这些溶剂，势必影响扩增检测效率。 4.3.3提取方法和操作因素 有效的核酸提取纯化方法应该是使病毒充分裂解释放出病毒核酸序列，同时又能保证该序列在后续 步骤中不被降解或极少降解；最后得到纯化核酸不应含有内源和外源性抑制物。 4.4检测试剂适用设备3对于使用开放设备的产品，对混样和核酸纯化的设备要进行抗污染能力验证（即高浓度样本和阴性 样本交错放置），对荧光PCR仪要定期进行校准，对可以使用不同型