IICS65.120 CCSB46 团体标准 T/SXSL09-2022 饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 Determinationofnitroimidazoledrugsandtheirmetaboliteresidues infeeds─Liquidchromatographytandemmassspectrometry 2022–08–12发布 2022–09–10实施 陕西省饲料协会发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SXSL09-2022 Ⅰ前言 本标准按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本标准某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由陕西省饲料协会提出并归口。 本文件起草单位：陕西秦云农产品检验检测股份有限公司，黑龙江省农产品和兽药饲料技术鉴定站、 陕西正能农牧科技有限公司、陕西鑫诚大唐畜牧有限公司、陕西艾丰唐农业科技有限公司。 本标准主要起草人：李宏、雷浩、高云峰、贺习文、刘妩妍、张博、王义辉、马红军、李祯、赵柳、 孙涛、许军红、李易轩、高勤叶、汪军明、李彦珍、赵娟、王璐。 本标准为首次发布。 本文件由陕西秦云农产品检验检测股份有限公司负责解释。 单位：陕西秦云农产品检验检测股份有限公司。 单位地址：陕西省渭南市经济技术开发区，永兴大道与建业路丁字口西南角。 电话：15719230525 邮编：714000 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SXSL09-2022 1饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件中规定了饲料中2-甲硝咪唑、4-硝基咪唑、奥硝唑、苯硝咪唑、地美硝唑、甲硝唑、卡硝 唑、氯甲硝咪唑、罗硝唑、羟甲基甲硝咪唑、羟基甲硝唑、羟基异丙硝唑、塞克硝唑、替硝唑、异丙 硝唑的液相色谱-串联质谱法测定方法。 本文件中适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中2-甲硝咪唑、4-硝基咪 唑、奥硝唑、苯硝咪唑、地美硝唑、甲硝唑、卡硝唑、氯甲硝咪唑、罗硝唑、羟甲基甲硝咪唑、羟基 甲硝唑、羟基异丙硝唑、塞克硝唑、替硝唑、异丙硝唑含量的测定。 本文件中2-甲硝咪唑、4-硝基咪唑、奥硝唑、苯硝咪唑、地美硝唑、甲硝唑、卡硝唑、氯甲硝咪 唑、罗硝唑、羟甲基甲硝咪唑、羟基甲硝唑、羟基异丙硝唑、塞克硝唑、替硝唑、异丙硝唑的检出限 为1.0ug/kg，定量限为3.0ug/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195动物饲料试样的制备 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 试样中的硝基咪唑类药物用乙酸乙酯提取，经MCX固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质谱仪 测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。 5试剂或材料 除非另有规定，仅使用色谱纯试剂。 5.1水：GB/T6682，一级。 5.2乙腈。 5.3甲醇。 5.4乙酸乙酯。 5.5正己烷。 全国团体标准信息平台 T/SXSL09-2022 25.6氨水：分析纯。 5.7甲酸。 5.8甲酸溶液（0.2%）：移取2mL甲酸于1000mL容量瓶中，用水稀释定容，混匀。 5.9甲酸溶液（0.1%）：移取1mL甲酸于1000mL容量瓶中，用水稀释定容，混匀。 5.10氨化甲醇溶液（5%）：移取5mL氨水于100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，混匀。 5.11标准品：地美硝唑（CAS:551-92-8，纯度≥98%）、异丙硝唑（CAS:14885-29-1，纯度均≥98%）、 甲硝唑（CAS:443-48-1，纯度≥98%）、塞克硝唑（CAS:3366-95-8，纯度≥98%）、罗硝唑（CAS:7681-76-7， 纯度≥98%）、奥硝唑（CAS:16773-42-5，纯度≥98%）、卡硝唑（CAS:42116-76-7，纯度≥98%）、替 硝唑（CAS:19387-91-8，纯度≥98%）、4-硝基咪唑（CAS:3034-38-6，纯度≥98%）、羟基甲硝唑 （CAS:4812-40-2，纯度≥98%）、2-甲硝咪唑（CAS:696-23-1，纯度≥98%）、羟甲基甲硝咪唑 （CAS:936-05-0，纯度≥98%）、氯甲硝咪唑（CAS:4897-25-0，纯度≥98%）、苯硝咪唑（CAS:94-52-0， 纯度≥98%）、羟基异丙硝唑（CAS:35175-14-5，纯度≥98%）。 5.12标准储备溶液(1mg/mL)：准确称取15种硝基咪唑类药物标准品(5.11)各10mg(精确到0.00001g) 分别于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释定容，混匀。贮存于棕色试剂瓶中，于-18℃以下保存， 有效期为6个月。 5.13混合标准溶液(10ug/mL)：准确移取15种硝基咪唑类药物的标准储备液（5.12）各0.1mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，混匀。贮存于棕色试剂瓶中，于-18℃保存，有效期为3个月。 5.14混合标准系列溶液:准确移取适量硝基咪唑类药物混合标准溶液(5.13)于10mL容量瓶中，用乙 腈稀释定容配制成浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的标准工 作溶液。临用现配。 5.15强阳离子交换固相萃取小柱：规格为200mg/6mL，或者性能相当者。 5.16微孔滤膜：0.22μm，有机系。 6仪器设备 6.1液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾电离源）。 6.2分析天平：感量0.0001g和0.00001g。 6.3涡旋混合器。 6.4振荡器。 6.5离心机：转速≥8000r/min。 6.6固相萃取装置。 6.7氮吹仪。 6.8分析筛：0.42mm。 7样品 按照GB/T20195的规定制备样品，粉碎后过0.42mm孔径分析筛，混匀，装入大磨口瓶中备用。选 取与待测样品类型相同，均匀一致，且在待测物保留时间处仪器响应面积小于方法定量限30%的饲料 样品，作为空白样品。 8试验步骤 8.1提取 全国团体标准信息平台 T/SXSL09-2022 3称取试样2g（精确至0.0001g）于50mL离心管中，准确加入10mL乙酸乙酯，涡旋1min，超 声提取10min，冷却至室温，于8000r/min离心5min，上清液转入另一支洁净的离心管中，残渣用 10mL乙酸乙酯复提取一次，合并提取液，于40℃氮气吹干，加入3mL0.2%甲酸溶液（5.8）溶解后， 再加入3mL正己烷，涡旋1min，弃去上层正己烷，下层溶液待净化。 8.2净化 强阳离子交换固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，将提取液全部过柱，使其流速不大 于1mL/min，用3mL水淋洗，抽干1min，加入3mL5%的氨化甲醇溶液洗脱（5.10），收集洗脱液于 40℃氮气吹干，准确加入1mL乙腈溶解，涡旋混匀。过膜后待测。 8.3基质匹配标准系列溶液 称取基质空白样品6份，按照8.1~8.2步骤操作处理至40℃氮气吹干，分别准确加入1mL混合标 准系列溶液（5.14），配制成浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL 的基质匹配标准系列溶液，混匀。过膜后待测。 8.4测定 8.4.1液相色谱参考条件 色谱柱：C18柱，柱长50mm，内径2.1mm，粒径1.9µm。或性能相当者。 流动相：A相：0.1%甲酸溶液（5.9）；B相：乙腈，洗脱条件见表1。 流速：0.2mL/min。 柱温：40℃。 进样量：2μL。 表1梯度洗脱条件 时间（min） A相(%) B相(%) 0.0 .090 10 1.0 90 10 5.0 10 90 7.0 10 90 7.1 90 10 10 90 10 8.4.2质谱参考条件 电离方式：电喷雾离子源（ESI+）； 监测方式：多反应监测（MRM）； 毛细管电压：3.5kV； 离子源温度：150℃； 脱溶剂温度：350℃。 硝基咪唑类药物的多反应监测（MRM）离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。 全国团体标准信息平台 T/SXSL09-2022 4表2硝基咪唑类药物的定性离子对、定量离子对及质谱条件 被测物名称定性离子对 m/z定量离子对 m/z锥孔电压 V碰撞能量 V保留时间 min 4-硝基咪唑114.1>68.1 114.1>68.1 4617 2.00 114.1>97.1 16 2-甲硝咪唑128.1>42.2 128.1>42.2 6031 2.26 128.1>82.1 17 地美硝唑142.1>81.1 142.1>81.1 5025 3.70 142.1>96.1 15 羟甲基甲硝咪唑158.1>55.2 158.1>55.2 4517 2.96 158.1>140.1 16 氯甲硝咪唑162.1>116.1 162.1>116.1 5317 5.20 162.1>145.1 15 苯硝咪唑164.1>91.1 164.1>91.1 5435 4.37 164.1>118.1 20 异丙硝唑170.1>109.1 170.1>109.1 5824 4.21 170.1>124.1 17 甲硝唑172.1>82.1 172.1>82.1 4624 2.31 172.1>128.1 14 塞克硝唑186.1>128.1