IICS65.120 CCSB46 团体标准 T/SXSL11-2022 饲料中香芹酚和百里香酚含量的测定 高效液相色谱法 Determinationofcaracoleandthymecontentinfeeds Highperformanceliquidchromatography 2022–08–12发布 2022–09–10实施 陕西省饲料协会发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SXSL11-2022 Ⅰ前言 本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由陕西省饲料协会提出并归口。 本文件起草单位：陕西秦云农产品检验检测股份有限公司、陕西鑫诚大唐畜牧有限公司、浙江启润 生物科技有限公司、陕西艾丰唐农业科技有限公司、黑龙江省农产品和兽药饲料技术鉴定站、陕西正能 农牧科技有限公司。 本文件主要起草人：李宏、雷浩、孙标、赵彩会、贺习文、刘妩妍、马红军、张博、高云峰、王义 辉、朱弘、赵柳、孙涛、许军红、田真、李易轩、高勤叶、汪军明、李彦珍、赵娟、王璐。 本文件为首次发布。 本文件由陕西秦云农产品检验检测股份有限公司负责解释。 单位：陕西秦云农产品检验检测股份有限公司。 地址：陕西省渭南市经济技术开发区，永兴大道与建业路丁字口西南角。 电话：15719230525 邮编：714000 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SXSL11-2022 1饲料中香芹酚和百里香酚含量的测定 高效液相色谱法 1范围 本文件中规定了饲料中香芹酚和百里香酚的高效液相色谱测定方法。 本文件中适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料和精料补充料中香芹酚和百里香酚的测 定。 本文件中香芹酚和百里香酚的检出限为0.25mg/kg，定量限为0.75mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适 用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195动物饲料试样的制备 3术语和定义 本文件没有特别需要界定的术语和定义。 4原理 试样中的香芹酚和百里香酚用乙腈提取，经过C18吸附材料和硅酸镁吸附材料净化，高效液相色 谱仪检测，外标法定量。 5试剂和材料 除特别注明外，仅使用分析纯的试剂。 5.1水：GB/T6682，一级水。 5.2乙腈：色谱纯。 5.3无水乙醇。 5.4冰乙酸。 5.5香芹酚标准储备溶液（1mg/mL）：准确称取10mg（精确至0.00001g）香芹酚标准品（CAS: 499-75-2，纯度≥98.0%）于10mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解定容，混匀。于2~8℃保存，有效 期6个月。 5.6百里香酚标准储备溶液（1mg/mL）：准确称取10mg（精确至0.00001g）百里香酚标准物品 （CAS:89-83-8，纯度≥98.0%）于10mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解定容，混匀。于2~8℃保 存，有效期6个月。 全国团体标准信息平台 T/SXSL11-2022 25.7混合标准中间溶液（100μg/mL）：准确吸取香芹酚标准储备溶液和百里香酚标准储备溶液各1.00 mL于10mL棕色容量瓶中，用流动相（5.9）定容，混匀。于2~8℃保存，有效期为3个月。 5.8标准工作溶液：准确吸取混合标准中间液（5.7）0.02mL、0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、 10.0mL于100mL棕色容量瓶中，用流动相（5.9）稀释定容，配制成浓度分别为0.02μg/mL、0.1μg/mL、 0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、10.0μg/mL的系列标准工作溶液。临用现配。 5.9流动相：移取10mL冰乙酸于1000mL容量瓶中，用水稀释定容，混匀。量取500mL冰乙酸 水溶液与500mL乙腈混匀。临用现配。 5.10C18吸附材料：粒径40-63μm，十八烷基键合硅胶吸附剂。 5.11硅酸镁吸附材料：粒径40-63μm，硅酸镁吸附剂。 5.12滤膜：有机系，0.22μm。 6仪器设备 6.1高效液相色谱仪：配备紫外检测器或二极管阵列检测器。 6.2分析天平：感量0.00001g和0.0001g。 6.3离心机：转速≥8000r/min。 6.4超声波提取仪。 6.5涡旋混合器：转速≥1000r/min。 6.6分析筛：孔径0.45mm。 6.7粉碎机。 7样品 选取具有代表性的样品至少500g，按照GB/T20195试样制备方法，用四分法缩减至200g，全 部粉碎，全部通过0.45mm孔径分析筛，充分混匀后，装入密闭容器中，作为试样备用。 8试验步骤 8.1提取 平行做两份试验。称取2g（精确至0.0001g）试样于50mL离心管中，准确加入10mL乙腈， 涡旋1min，超声提取20min，期间每隔5min振摇5s，于8000r/min离心5min，取全部上清液转入 另一离心管中，残渣用10mL乙腈复提取一次，合并提取液，待净化。同时做试剂空白试验。 8.2净化 准确移取上清液5mL于10mL离心管中，加入0.1gC18吸附材料和0.1g硅酸镁吸附材料，涡旋 混匀1min，静置1min，取上清液过膜后待测。 8.3液相色谱参考条件 色谱柱：C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或性能相当者。 流速：1.0mL/min。 柱温：30℃。 波长：275nm。 进样量：10μL。 全国团体标准信息平台 T/SXSL11-2022 38.4测定 8.4.1标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下，分别取标准系列溶液和试样溶液上机测定。香芹酚和百里香酚标准溶液的 液相色谱图参见附录A。 8.4.2定性 以保留时间定性，试样溶液中香芹酚和百里香酚保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中香芹 酚和百里香酚的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。 8.4.3定量 以香芹酚和百里香酚的浓度为横坐标，色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘制标准曲线，其相关 系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应用流动相 稀释后，重新测定。单点校准定量时,试样溶液中待测物的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。 9试验数据处理 试样中香芹酚和百里香酚的含量ωi以质量分数表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1） 计算： ..............................（1） 式中： Pi—从标曲中查得的试样中香芹酚或百里香酚的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； P0—试剂空白溶液中香芹酚或百里香酚的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V—提取溶液的总体积，单位为毫升（mL）； n—试样溶液浓度超出曲线后的稀释倍数； m—试样的质量，单位为克（g）； 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 10精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果与其值算术平均值的绝对差值不大于该平均值的10%。 T 全国团体标准信息平台 T/SXSL11-2022 4附录A (资料性附录) 香芹酚和百里香酚的液相色谱图 A.1香芹酚和百里香酚（1μg/mL）的液相色谱图见图A.1。 图A.1香芹酚和百里香酚（1μg/mL）的液相色谱图 ——————————数据文件名:211028-香芹酚-1.lcd 样品名:香芹酚百里香酚 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min0.02.55.07.510.012.515.017.520.0mV 检测器A 275nm 香芹酚 百里香酚 全国团体标准信息平台