ICS 67.120.20 B 40 团体 标准 T/SHZSAQS 017—2020 快速检测绵羊有角性状基因标记 技术规程 2020- 12 - 26发布 2020 -12 - 31实施 石河子市质量标准化协会 发布 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 017—2020 I 目 次 前言 ................................ ................................ ................ II 1 范围 ................................ ................................ .............. 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ .... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ........ 1 3.1 rxfp2 ................................ ................................ ............ 1 4 主要试剂配制 ................................ ................................ ...... 1 4.1 20 mg/mL 蛋白酶K ................................ .............................. 1 4.2 柠檬酸（ ACD）抗凝剂 ................................ ............................. 1 4.31mol/L Tris ................................ ................................ ...... 1 4.4 0.5M EDTA(pH8.0) ................................ ............................... 1 4.5 TE(pH8.0) ................................ ................................ ....... 2 4.6 PBS ................................ ................................ ............. 2 4.7 DNA抽提缓冲液 ................................ ................................ ... 2 5 检测方法 ................................ ................................ .......... 2 5.1 样本采集 ................................ ................................ ........ 2 5.2 DNA提取 ................................ ................................ ......... 2 5.3 DNA浓度和纯度测定 ................................ ............................... 2 6 引物设计 ................................ ................................ .......... 2 7 PCR扩增 ................................ ................................ ........... 3 7.1 PCR反应体系 ................................ ................................ ..... 3 7.2 PCR反应条件 ................................ ................................ ..... 3 7.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 ................................ ....................... 3 8 绵羊有角性状结果判断 ................................ .............................. 3 附录A（资料性附录） 绵羊有角性状基因标记 rxfp2基因判断标准图谱 ............... 4 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 017—2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准附录 A为资料性附录。 本标准起草单位：新疆农垦科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：徐梦思、甘尚权、刘守仁、杨鹏。 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 017—2020 1 快速检测绵羊有角性状基因标记技术 规程 1 范围 本规程规定了快速检测绵羊有角性状基因标记的分子检测方法。 本规程适用于快速检测绵羊有无角性状。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用 于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 rxfp2 松弛素受体 2/胰岛素样因子 2(relaxin/insulin -like family peptide receptor 2, rxfp2)是 一种糖蛋白激素，富含亮氨酸重复序列的 G蛋白偶联受体。研究表明。在 rxfp2基因上的 缺失与插入 突变与绵羊角的发育和类型紧密相关，无角型绵羊在 rxfp2基因3’UTR区域存在 1.78 kb的插入，而有 角型绵羊则在该区域不存在 1.78 kb的插入。 4 主要试剂配制 4.1 20 mg/mL 蛋白酶K 20 mg蛋白酶K溶于1 mL灭菌双蒸水， -20 ℃保存。 4.2 柠檬酸（ACD）抗凝剂 柠檬酸0.48 g，柠檬酸钠 1.32 g，葡萄糖 1.47 g定容于100 mL水中，高压灭菌 20 min。每 6 mL新鲜血液中加入 1 mL的ACD抗凝剂。 4.31mol/L Tris 121.1 g Tris 碱溶于800 mL蒸馏水中，加入 浓HCl调节pH值至8.0，加水定容至 1 L，分装 后高压灭菌。 4.4 0.5M EDTA(pH8.0) 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 017—2020 2 186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na.2H2O）溶于800 mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅 拌，用NaOH调节溶液 pH至8.0，然后定容至 1 L，高压灭菌。 4.5 TE(pH8.0) 1mol/L Tris.Cl(pH8.0) 10 mL 、0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2 mL 加水定容至 1 L，高压灭菌。 4.6 PBS NaCl 8.0 g 、KCl 0.2 g 、Na2HPO4 1.44 g 、KH2PO4 0.24 g 溶于700 mL水中，用 HCl调节pH 至7.4,，加水定容至 1 L，高压灭菌。 4.7 DNA 抽提缓冲液 取1 mol/L Tris.Cl 2.5 mL 、0.5 M EDTA(pH8.0) 50 mL 、10% SDS 12.5 mL 加水定容至 250 mL， 高压灭菌。 5 检测方法 5.1 样本采集 每只绵羊颈静脉采血量为 10 mL，ACD抗凝。采血后，颠倒混匀防治血液凝固， -20℃冻存。 5.2 DNA 提取 取750 μL冻存血样加入等量 PBS，混合均匀， 12000 rpm 离心5 min，弃上清；加入 450 μL DNA 抽提buffer，重悬沉淀；加入 RNase至终浓度 20 μg/mL，37 ℃温育1小时；加入蛋白 酶K至终 浓度100 μg/mL，混匀， 55 ℃水浴消化过夜；加入等体积 Tris饱和酚，温和摇动 10 min，12000 rpm离心5 min；将上层水相转移至另一干净离心管中；再加入等体积的酚：氯仿和氯仿，各抽提 一次；上层水相用 1/5体积乙酸铵和 2倍体积无水乙醇沉淀 DNA；12000 rpm 离心10 min，收集沉 淀，70 %乙醇洗涤；真空抽干，用适量 TE (pH8.0) 溶解DNA。 5.3 DNA 浓度和纯度测定 取2～10 μL待测DN