广东省农药协会 发布ICS65.100 C263T/GDP 广东省农药协会团体标准 T/GDP010-2020 2020-12-28发布高纯度苦瓜素类化合物的制备技术标准 TechnicalStandardforpreparationofhighpurityMomordicinecompounds fromMomordicacharantia 2020-12-28实施 全国团体标准信息平台 T/GDP010-2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2020的规定编制。 本标准由华南农业大学提出。 本标准由广东省农药协会归口。 本标准起草单位：华南农业大学、广州禾立田生物科技有限公司、韶关禾立田农场有限公司、从化海 关综合服务技术中心、韶关市曲江区田园农业科技发展有限公司、广州市会兴农业科技有限公司。 本标准的主要起草人为：金丰良，许小霞，孔锦容，张展滔，李树忠，王泽清、邵振芳、颜素娟、陈 伟。 本标准为首次发布。 全国团体标准信息平台 T/GDP010-2020 1高纯度苦瓜素类化合物的制备技术标准 1范围 本部分规定了高纯度苦瓜素类化合物苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜素L的制备方法。 本标准适用于高纯度苦瓜素类化合物苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜素L的制备方法。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 HY/T229-2018海洋生物活性物质标准样品结构确证方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1高效液相色谱highperformanceliquidchromatography 仪器配置包括：色谱泵及控制器、色谱柱、检测器、进样器、数据处理及控制。以液体为流动相，通 过高压输液系统，把不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱 柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 3.2浸提法extractionmethod 用挥发性有机溶剂将原料中的某些成分转移到溶剂相中，然后通过蒸发、蒸馏等手段回收有机溶剂， 而得到所需的较为纯净的萃取组分。 3.3真空抽滤vacuumfiltration 抽滤装置一般由布氏漏斗、抽滤瓶和抽气泵组成。利用抽气泵使抽滤瓶中的压强降低，达到固液分离 的目的的方法。 3.4液质联用highperformanceliquidchromatographymassspectrometry 以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的 质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。 全国团体标准信息平台 T/GDP010-2020 23.5核磁共振谱nuclearmagneticresonancespectroscopy 研究原子核对射频辐射(Radio-frequencyRadiation)的吸收，它是对各种有机和无机物的成分、结构进 行定性分析的最强有力的工具之一，有时亦可进行定量分析。本方法主要应用氢谱和碳谱鉴定分子结构式。 4试剂耗材、仪器设备 4.1试剂耗材 本方法高效液相色谱系统所使用的试剂均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规 定的一级水。 甲醇、二甲基亚砜DMSO为国产分析纯。 双圈滤纸、0.22μm微孔滤膜、一次性注射器。 4.2仪器设备 高效液相色谱、真空抽滤装置、旋转蒸发仪、冻干机。 5制备流程 5.1样品前处理 新鲜苦瓜茎叶干燥，研磨成粉。 5.2浸提 用甲醇对苦瓜茎叶干粉进行浸提24h，甲醇与苦瓜茎叶干粉的用量比为1:5（g:mL），对浸提液进行 真空抽滤，并通过旋转蒸发仪进行蒸馏浓缩，得到粗提物。 5.3高效液相色谱分离 5.3.1一级高效液相色谱分离 使用甲醇溶解5.2所得到的粗提物，并用0.22μm滤膜进行过滤。对过滤后的粗提物进行一级高效液相 色谱分离，分离的的参数为：流动相为80%甲醇、柱温度为28℃、流速为2.5mL/min、分离柱为Agilent XB-C18、检测波长为210nm。分别收集18～26min时间段和30～42min时间段的流出液，通过旋转蒸发 仪进行蒸馏浓缩，并通过冻干机进行冷冻干燥，即得一级分离物1和一级分离物2。 5.3.2二级高效液相色谱分离 使用甲醇溶解5.3.1所得到的一级分离物1和一级分离物2，并用0.22μm滤膜进行过滤。分别对过滤 后的一级分离物1和一级分离物2进行二级高效液相色谱分离，分离的参数与一级高效液相色谱分离参与 相同。对于一级分离物1分别收18～22min时间段和24～26min时间段的流出液，蒸馏浓缩，冷冻干燥， 得二级分离物1-1和二级分离物1-2，对于一级分离物2收集33～37min时间段的流出液，蒸馏浓缩，冷 全国团体标准信息平台 T/GDP010-2020 3冻干燥，得二级分离物2-1。 5.3.3三级高效液相色谱分离 使用甲醇溶解5.3.2所得到的二级分离物1-1、二级分离物1-2、二级分离物2-1，并用0.22μm滤膜进 行过滤。分别对过滤后的二级分离物1-1、二级分离物1-2、二级分离物2-1进行三级高效液相色谱分离， 分离的参数与一级高效液相色谱分离参与相同。分别收集20～23min时间段、23～26min时间段以及34～ 37min时间段的流出液，蒸馏浓缩，冷冻干燥，分别得到纯度为95%以上的苦瓜素Ⅱ、苦瓜素L和苦瓜素Ⅰ。 6物质鉴定 参照HY/T229-2018海洋生物活性物质标准样品结构确证方法中的结构确证方法对所得的苦瓜素类 化合物进行结构确证。 全国团体标准信息平台 T/GDP010-2020 4附录A （资料性附录） 苦瓜素Ⅱ、苦瓜素L和苦瓜素Ⅰ的结构信息 A.1苦瓜素Ⅱ A.1.1理化性质 白色粉末，易溶于甲醇、丙酮，难溶于水。 A.1.2液相色谱 结果见图A.1。 图A.1苦瓜素ⅡHPLC色谱图 A.1.3质谱 ESI-MS:[M+Na]+为m/z657[M+Na]+，分子量为634，分子式C36H58O9。 A.1.4核磁共振谱 1HNMR(400MHz,C5D5N)δ:10.65(1H,s,H-19),6.27(1H,d,J=4.4Hz,H-6),5.61(1H,d,J=7.8Hz,H-24), 4.96(1H,d,J=7.8Hz,Glc-1),4.96(1H,d,J=7.6Hz,H-23),4.46(1H,d,J=10.8Hz,Glc-6b),4.35(1H,d,J=10.8Hz, Glc-6a),4.35(1H,d,J=5.2Hz,H-7),4.21(2H,brd,J=6.0Hz,Glc-3,4),4.01(1H,brs,Glc-2),3.88(1H,brs, Glc-5),3.81(1H,brs,H-3),2.71(1H,m,H-10),2.37(1H,s,H-8),2.07(1H,m,H-20),1.75,1.71(each3H,s,H-26 全国团体标准信息平台 T/GDP010-2020 5andH-27),1.19(3H,d,J=6.4Hz,H-21),1.48,1.12,0.90,0.87(each3H,s)。 13CNMR(100MHz,C5D5N):结果见表A.1。 表A.1苦瓜素Ⅱ的13CNMR谱数据列表 C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12 21.929.875.641.7145.7124.365.750.550.636.822.729.6 C13C14C15C16C17C18C19C20C21C22C23C24 45.948.234.927.851.214.9207.732.619.443.775.3129.1 C25C26C27C28C29C3023-glc23-glc23-glc23-glc23-glc23-glc 132.218.226.225.827.318.2104.175.678.971.978.263.0 A.1.5分子结构图 结果见图A.2。 23-O-β-D-glucopyranosyl-3,7-dihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al 图A.2苦瓜素Ⅱ分子结构图 A.2苦瓜素L A.2.1理化性质 白色片晶，易溶于甲醇、丙酮，难溶于水。 A.2.2液相色谱 结果见图A.3。 全国团体标准信息平台 T/GDP010-2020 6 图A.3苦瓜素LHPLC色谱图 A.2.3质谱 ESI-MS:[M+Na]+为m/z495[M+Na]+，分子量为472，分子式C30H48O4。 A.2.4核磁共振谱 1HNMR(400MHz,CD3OD)δ:0.81,0.86,1.07,1.24(each3H,s,CH3-18,28,29,30),1.25(6H,s,CH3-26, 27),0.94(3H,d,J=5.6Hz,CH3-21),3.54(1H,brs,H-3),3.99(1H,brd,J=5.6Hz,H-7),5.57(2H,brs,H-23,24), 9.87(1H,s,H-19)。 13CNMR(100MHz,MetoD):结果见表A.2。 表A.2苦瓜素L的13CNMR谱数据列表 C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12 21.929.877.042.3140.7123.866.930.251.337.635.737.6 C13C14C15C16C17C18C19C20C21C22C23C24