ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 16—2020 羊传染性脓疱病毒微滴式数字 PCR检测方法 Method of droplet digital PCR for ovine contagious ecthyma virus 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 16-2020 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林省动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防 控制中心，长春科技学院。 本文件主要起草人：邵洪泽、王楠、于钦磊、葛晨霞、 王建超、马晓媛、白翠、原霖、董航、任锐、 王欣宇、李昱洁、张兴菊、宋天辉、田春雨。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 16-2020 1 引 言 微滴式数字 PCR（Droplet Digital PCR ，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成 数万个纳升级的微滴进行定量 PCR检测，本质上是将传统定量 PCR的一次检测变成数万次检测，提高了 核酸序列检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴， 每 个微滴不含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的 PCR扩增体系，在 PCR 扩增仪上进行终点 PCR扩增。利用微滴分析仪对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为 1，没有 荧光信号的微滴判读为 0。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷 贝数。本文件针对羊传染性脓疱病毒设计特异性引物和探针进行微滴式数字 PCR扩增，并根据扩增结果 来判断羊传染性脓疱病毒核酸含量。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 16-2020 2 羊传染性脓疱病毒微滴式数字 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了羊传染性脓疱病毒微滴式数字 PCR检测方法的试验条件、试剂与耗材、仪器设备、样 品、试验步骤、结果分析。 本文件适用于羊传染性脓疱病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术要求 NY/T 3235 羊传染性脓疱诊断技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微滴式数字 PCR droplet digital PCR 利用微滴化技术将一份反应体系分成数万个纳升级的微滴进行定量 PCR 检测，本质上是将传统 PCR 的一次检测变成数万次检测，提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度。 4 试验条件 4.1 生物安全 要求 所有样品、培养物和废弃物 的处置应符合 GB 19489 的规定。 4.2 防污染措施 防止污染措施应符合 GB/T 27401的规定。 5 试剂与耗材 5.1 核酸提取试剂 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 16-2020 3 商品化的手动或自动化病毒 DNA提取试剂盒。 5.2 微滴式数字 PCR 扩增试剂与耗材 按照不同的微滴式数字 PCR平台的说明书选取推荐的微滴式数字 PCR扩增试剂与耗材。 5.3 引物和探针 上游引物（ F）： 5’-TTGCACATGTCCGTGAAGAAGT -3’ 下游引物（ R）： 5’-AGGCGGTGGAATGGAAAGAC -3’ 探针（ P）： 5’-（FAM）-CGGGTAGTCTTTGGAGTC -（TAMRA）-3’ 6 仪器设备 生物安全柜、组织研磨仪、核酸提取仪、高速冷冻离心机、涡旋震荡仪、核酸定量仪、数字 PCR微 滴发生器、 PCR扩增仪、数字 PCR微滴分析仪。 7 样品 7.1 样品采集及运输 样品采集及运输按照 NY/T 541 的规定执行。 7.2 样品处理 样品处理按照 NY/T 3235 的规定操作。 7.3 样品保存 采集或处理好的样品在 2 ℃~8 ℃保存应不超过 24 h。如需长期保存，应置 -70 ℃以下保存， 避免反 复冻融。 8 试验步骤 8.1 DNA提取 按照所选取的病毒 DNA提取试剂盒说明书进行提取。 8.2 微滴式数字 PCR 扩增方法 微滴式数字 PCR扩增体系配制 按照表1进行。该步骤按照不同微滴式数字 PCR平台的说明书进行操 作。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 16-2020 4 表1 微滴数字 PCR反应体系 试剂成分 终浓度 体积 2×酶混合液a 1× 10.0 µ L F（10 µ mol/L ） 0.5 µmol/L 1.0 µ L R (10 µ mol/L ） 0.5 µmol/L 1.0 µ L P（10 µ mol/L ） 0.1 µmol/L 0.2 µ L DNA模板 / 2.0 µ L 无核酸酶水 / 5.8 µ L 总体系 / 20.0 µ L 注：使用微滴式数字 PCR 平台进行实验时应依据不同微滴式数字 PCR 平台说明调整扩增体系的组分和最终体积，表 中所列组分的终浓度不变。 a 微滴式数字 PCR 扩增试剂。 8.3 微滴生成 反应液配制后，利用数字 PCR微滴发生器上完成 20 µ L反应体系的生成。 8.4 PCR反应 微滴生成后， 在 PCR扩增仪上扩增， 扩增程序 按照表2进行， 扩增后在数字 PCR微滴分析仪上分析， 分析步骤采用 FAM单荧光通道。 表2 微滴数字 PCR扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 95 ℃ 5 min 1 2 95 ℃ 15 s 40 3 58 ℃ 1 min 4 98 ℃ 10 min 1 5 4 ℃ 60 min 1 注：升降温速度设置为 2.5 ℃/s，不同 PCR反应平台可以根据说明书对热启动步骤程序进行修改，但不能对扩增程序进 行修改。 8.5 反应的对照 在进行微滴式数字 PCR实验时，应设置阳性对照、阴性对照与空白对照。以提取的含有 羊传染性脓 疱病毒 DNA溶液作为阳性对照。以提取的健康羊组织悬液核酸作为阴性对照。以无核酸酶水作为空白 对照。各对照 PCR扩增体系中，除模板外，其余组分一致 按照表1操作，PCR扩增程序 按照表2操作。 9 结果分析 9.1 实验成立条件 阳性对照羊传染性脓胞病毒基因有明显扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值；阴性对照羊传染 性脓胞病毒基因无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值；空白对照羊传染性脓胞病毒基因无扩增，扩增终 点荧光信号小于阈值。与以上实验结果不符，需要重复验证实验步骤。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 16-2020 5 9.2 阈值设定 根据数字 PCR体系中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的阈值限。 阈值限需要对空白和阳性扩增 结果进行明显的区分。 9.3 结果判定 样品中羊传染性脓胞病毒基因未得到扩增，扩增终点荧光信号小于阈值，可判定样品结果为阴性， 报告未检出羊传染性脓胞病毒基因。 样品中羊传染性脓胞病毒 基因得到扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值，可判定该样品结果为 阳性，报告检出羊传染性脓胞病毒基因。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台