ICS 11.220 B 41 T/CVMA 19 -2020 猪圆环病毒 3型荧光PCR检测方法 Real-time PCR assay for detection of porcine circovirus type 3 2020-12-22 发布 2020-12-22 实施团体标准 中 国 兽 医 协 会 发 布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 19-2020 - 1 - 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 的规定起草。 本文件由中国兽医协会 提出并归口。 本文件起草单位：青岛立见诊断技术发展中心、中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医 药品监察所。 本文件主要起草人：张志、孙学强、李阳、刘爽、徐烽烨、宫枫举、官丽娟、邵钰、李翠 翠、李晓成、蒋文明、于晓慧、王琳、周晓翠、王团结。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 19-2020 - 2 - 猪圆环病毒 3型实时荧光 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了猪圆环病毒 3型实时荧光 PCR检测的技术要求。 本文件适用于猪圆环病毒 3型的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的 条款。其中，注明日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCV 3：猪圆环病毒 3型（ porcine circovirus type 3 ） 荧光 PCR：实时荧光聚合酶链式反应（ Real-time PCR ） Ct：扩增循环次数（ Threshold cycle） FAM：羧基荧光素（ Carboxyfluorescein ） 5 仪器设备与耗材 5.1 荧光 PCR检测仪 5.2 台式冷冻离心机（可控温至 4 ℃、离心速度可达 12000 r/min 以上） 5.3 冰箱（ 2 ℃~8 ℃ 、-20 ℃和-70 ℃三种） 5.4 微量移液器（ 0.1 μL~2.5 μL 、1 μL~10 μL 、10 μL~100 μL 、100 μL~1000 μL ）及匹配的吸 头 5.5 高压灭菌锅 5.6 耗材 5.6.1 1.5 mL 离心管 5.6.2 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管 5.6.3 10 μL ~200 μL带滤芯吸头 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 19-2020 - 3 - 5.6.4 15 mL 样品保存管 6 试剂 6.1 病毒 DNA提取试剂盒 6.2 PCV 3 检测引物和荧光探针，其序列如下： 上游引物 qPCV3 -F：5’-CGGAGACGKCGGGAAATCTG -3’； 下游引物 qPCV3 -R：5’-CCCCCGTGGCTTGAAATAC -3’； 荧光探针 qPCV3 -Probe：5’-FAM -CACCCCGCAAAAATCACGCAAACC -BHQ1 -3'。 6.3 荧光 PCR反应液 荧光 PCR反应液的配制按照附录 A配置，除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，试验用 水符合 GB/T 6682 的要求。 6.4 阴性及阳性对照 阴性对照和阳性对照的制备方法，按照附录 B配置。 7 样品的采集、保存和运输 7.1 样品的采集 样品的采集与运输按照 NY/T 541 的规定执行。 可取猪的主要脏器 （脾脏、 扁桃体、 淋巴结） 、 EDTA抗凝全血等适量（ 5 g~10 g）装入灭菌的 15mL样品保存管中，编号，备用。优先使用组织 样品，其次为抗凝血。 7.2 样品的保存 上述采集的样品 可立即用于检测。如不能立即检测，样品保存在 2 ℃~8 ℃ 条件下不超过 24 h，-20 ℃下保存 3个月， -70 ℃可以保存数年以上。 7.3 样品的运输 必须低温保存运输样品，且在规定温度下的保存期内送达和检测。 7.4 样品的处理 7.4.1 抗凝血液样品：无需进行处理，直接用于核酸提取。 7.4.2 组织样品：取 1 g解冻的组织，剪碎，加入 5mL PBS （0.01 M，pH 7.2）进行研磨，制备 组织匀浆， 8 000 r/min 离心 5 min，取上清用于后续的核酸提取。 8 荧光PCR操作程序 8.1 样品 DNA提取 样品 DNA提取在核酸提取区进行 ，分区要求和基因扩增见 SN/T 1193 ，涉及的实验室生物安 全管理要求见 GB 19489 。 可用商品化的 DNA提取试剂盒提取样品的 DNA。 提取的 DNA应立即进 行实时荧光 PCR扩增；如 DNA模板需在 4 ℃保存，不宜超过 24 h，或应置 -20 ℃或-70 ℃保存。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 19-2020 - 4 - 8.2 反应体系的配置 在反应配置区进行。 每个检测反应体系使用 18 μL的荧光 PCR反应液， 2 μL的引物混合液 （含 终浓度为 0.5 μm的上下游引物和探针），再分别加入提取的 DNA溶液 5 μL，使每管总体积达到 25 μL，编号，盖紧管盖， 500 r/min 离心 30 s。 8.3 荧光 PCR反应 在检测区进行。在荧光 PCR仪上选用 FAM通道，设置如下反应参数： 95 ℃变性 3 min，然后 40个循环（ 95 ℃ 10 s ，60 ℃ 15 s ），并在循环反应中 60 ℃采集 FAM 信号。 9 结果判定 9.1 阈值设定 阈值设定原则根据不同的荧光 PCR仪的噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性样品扩 增的最高点为准。 9.2 质量控制 读取每个样品的 Ct值。当标准阳性对照有特异性扩增曲线而且 Ct值≤30，标准阴性对照无特 异性扩增曲线，说明质控合格。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效， 需重新进行。 9.3 结果描述及判定 9.3.1 被检样品有特异性扩增曲线，而且 Ct值≤37，判定为 PCV -3核酸阳性。 9.3.2 被检样品无 S型特异性扩增曲线，判定为 PCV -3核酸阴性。 9.3.3 被检样品有 S型特异性扩增曲线，而且 37<Ct值＜ 40，判定为可疑，可疑样品重新检测。 如重复检测后 Ct值＜ 40，且扩增曲线为典型的 S型特异性曲线，判定为 PCV -3核酸阳性，否则判 定为 PCV -3核酸阴性。 10 注意事项 10.1 本方法使用国家农业行政主管部门批准的其他检测引物、探针时，应对检测程序和判定 标准作相应调整。 10.2 本方法中的核酸提取可用酚 -氯仿法，也可使用商品化的核酸提取试剂盒。 10.3 本方法使用过的实验器材和 PCR反应管，禁止高温高压处理，应用 2 %的84消毒液浸泡 30 min后，再废弃处理。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 19-2020 - 5 - 附 录 A （规范性） 荧光 PCR反应液组成 荧光 PCR反应液组成 1×荧光 PCR反应液含： 50 mmol/L KCl ，10 mmol/L Tris -HCl（pH 8.3），2.5 mmol/L MgCl 2， 0.2 mmol/L dNTP mix ，1U Taq酶， 2 mmol/L DTT ，5 %甘油，其余为无核酶水。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 19-2020 - 6 - 附 录 B （规范性） 阳性对照和阴性对照 B.1 阴性对照 取1 g健康猪的脾脏等组织样品，剪碎，加入 5 mL PBS （0.01 M，pH7.2）进行研磨，制备 组织匀浆， 60 ℃水浴 30 min，8 000 r/min 离心 5 min， 取上清用孔径为 0.22 μm的滤膜过滤后分装， 即为阴性对照。 B.2 阳性对照 采用人工合成的方法合 成一段含有 PCV -3靶序列的核酸，该核酸序列为本文件 6.2中上下游 引物对应的核酸靶基因序列，将合成的序列连接到 pUC18载体中，作为阳性对照。 其核酸序列为： cggagacggcgggaaatctgactgaagttgctgagaagatgcctgcagtatttatacgctatgggcgggg tttgcgtgatttttgcggggtgatggggttgggtaaaccgcgtgattttaaaactgaagtttatgtttttattgg