ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 29-2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体化学发光 免疫分析检测方法 Chemiluminescent immunoassay for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antibody 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 29 -2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标 准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、 中国农业大学、 洛阳现代生物技术研究院有限公司、 洛阳莱普生信息科技有限公司 本文件主要起草人：杨林、杨汉春、李秀梅、王传彬、盖新娜、刘近、周智、耿玉静、吕园园、任 雪建、李硕、刘洋、赵柏林、毕一鸣 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 29 -2020 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体化学发光免疫分析检测方法 1 范围 本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的化学发光免疫分析检测方法 。 本文件适用于化学发光法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体， 适用于评估养殖场 猪繁殖与呼吸综合 征疫苗免疫状况， 可用于猪繁殖与呼吸综合征疫病的调查 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂与耗材 4.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组蛋白 P28-N的制备，应符合附录 A的规定。 4.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒酶标单克隆抗体的制备 ，应符合附录 B的规定 4.3 包被缓冲液，按照附录 C.1配制 4.4 封闭缓冲液，按照附录 C.2配制 4.5 酶结合物稀释液，按照附录 C.3配制 4.6 校准品稀释液，按照附录 C.4配制 4.7 校准品 1，按照附录 C.5配制 4.8 校准品 2~校准品 6，按照附录 C.6配制 4.9 25倍浓缩洗涤液， 按照附录 C.7配制 4.10 化学发光底物 A，按照附录 C.8配制 4.11 化学发光底物 B，按照附录 C.9配制 5 器材与设备 化学发光免疫分析仪、分析天平、洗板机、 37 ℃温箱、 2 ℃~8 ℃冰箱、﹣ 20 ℃冰箱、单道微量移 液器（ 0.5 µ L ~10 µ L；10 µ L ~100 µ L；20 µ L ~200 µ L；100 µ L ~1000 µ L）、多道移液器（ 300 µ L）、与 移液器匹配的枪头、酶标板、血清稀释板（ 96孔一次性 U型血凝板或 96孔细胞培养板）、一次性注射 器（ 5 mL、10 mL）。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 29 -2020 2 6 操作步骤 6.1样本采集与运输 样品采集、保存及运输按照 NY/T 541 的规定执行。采集猪血清或血浆用于检测，样品应在冷藏条 件下运输至实 验室，避 免反复冻融。 运输时间应尽量缩短。 6.2 实验过程 6.2.1包被 使用包被缓冲液将猪繁殖与呼吸综合征病毒重组蛋白 P28-N稀释之 2 μg/mL，每孔加 100 μL，置于 4 ℃包被 16 h~24 h。 6.2.2 洗板 弃去包被液，将 25倍浓缩洗涤液稀释成 1倍洗涤液，用 260 μL~300 μL洗涤液洗涤板孔，洗板 2次。 每次洗涤后应弃去孔内的液体。最后一次洗涤液弃去后，将包被板在吸水纸上拍干，直至孔内无残留洗 涤液。 6.2.3 封闭 每孔加入 150 μL封闭液，置于 4 ℃封闭 16 h~24 h。弃去封闭液，在吸水 纸上拍干。 6.2.4 干燥 置于 37 ℃干燥 3 h~5 h。装入铝箔袋，加干燥剂，抽真空，置于 2 ℃~8 ℃保存备用。 6.2.5 加样 取出包被板。首先在血清稀释板上依次加入校准品 1~6各30 μL，其余各孔依次加入待检样品各 30 μL，再向以上各孔均加入 60 μL 酶结合物，震荡混匀；每孔吸取 75 μL转移至包被板对应孔内。 6.2.6温育 置37℃恒温培养箱中温育 29 min~31 min。 6.2.7洗板 将各孔的液体弃入废液筒，用 260μL~300μL 洗涤液洗涤板孔，共洗涤 5次，每次洗涤后应弃去孔内 的液体。最 后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。 6.2.8加入底物 每孔各加入 50 µL的化学发光底物 A和50 µL的化学发光底物 B，振荡混匀（也可 将化学发光底物 A、 B等比例混匀后加 100 µL）。 6.2.9静置 在15 ℃~25 ℃条件下避光静置 5 min。(类似的单位相同修改 ) 6.2.10读值 静置后 15 min内用化学发光仪读取发光值。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 29 -2020 3 6.2.11结果计算方法 以校准品 1至校准品 6的发光值为纵坐标， 对应的抗体剂量值 （ 0 NCU/mL 、10 NCU/mL 、20 NCU/mL 、 40 NCU/m L、100 NCU/mL 、200 NCU/mL ）为横坐标，通过 ELISACalc 软件绘制校准品的四参数拟合曲 线，四参数模式为 Y=(a -b)/[1+(x/c) *b]+d。将样本的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中猪繁殖 与呼吸综合征病毒抗体剂量值。 6.2.12 试验成立条件 将6个校准品的发光值与对应抗体剂量值进行四参数拟合， R2≥0.99，试验成立。 否则，试验不成立。 6.2.13 结果判定 将样品的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中 猪繁殖与呼吸综合征 病毒抗体的剂量值 。当样 品的抗体剂量值＜ 40 NCU/mL， 样品应判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性； 如果样品的抗体剂量 值≥40 NCU/m L，则该样品判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 29 -2020 4 附 录 A (规范性) 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组蛋白 P28-N的制备 A.1 重组表达质粒的制备及鉴定 生产用菌液繁殖将生产用细菌种子按 1∶100 比例转接含 Kan+的LB 液体培养基中，置 37 ℃培养 至OD600nm 值为 0.65，收集菌液，提取质粒并进行双酶切鉴定。挑取单个卡那霉素（ Kan）抗性转化 子，接种含 Kan的LB培养基，过夜培养，用碱裂解法提取 质粒。采用特异性引物进行 PCR 扩增，电 泳鉴定扩增片段；用双酶切重组质粒，电泳检查插入片段的大小；并进行序列测定。 A.2基因工程重组表达菌的诱导表达 将鉴定后的重组表达质粒转化 BL21(DE3) 感受态细胞，利用 Kan 抗性筛选重组转化子。进行靶蛋 白的诱导表达及 SDS-PAGE分析。 A.3可溶性重组蛋白 P28-N的纯化 将25 ℃ 诱导培养 4 h的重组菌 200 mL离心后，按约 1 :10（M/V）的比例加入预冷的含 1 % Triton X-100，1 mmol/L PMS F，2 mmol/L DTT 。500 mmol/L NaCl 的20 mL磷酸盐缓冲液（ pH8.0） ，超声裂 解、离心处理的 上清经 0.22 μm的滤器过滤后，加入 1 mL镍亲合层析基质，装柱 4 ℃ 作用 30 min。依 次用 10ml~2 0ml含10 mmol/L 咪唑和 20 mmol /L 咪唑， 500 mmol/L NaCl 的磷酸盐缓冲液洗涤 3次； 并用考马斯亮兰 G-250检测试剂（ Bradford 法）间隔检测洗脱液。再用含 100 mmol/L ~500 mmol/L 咪 唑的磷酸盐缓冲液洗脱含 His-tag的重组蛋白P28-N，分管收集，洗脱流速控制在 5 mL/h ~7 mL /h。 SDS-PAGE 检验纯化蛋白的纯度，合并仅有目的蛋白的收集管，经分子截量 3 kD的蛋白浓缩管 （YM-3 型， Millipore 产品）浓缩后， 4 ℃下磁力搅拌 PBS液快速透析 4 h，收集蛋白 -70 ℃ 保存。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 29 -2020 5 附 录 B (规范性) 猪繁殖与呼吸综合征病毒酶标单克隆抗体的制备 B.1 单克隆抗体的制备 B.1.1用HT选择培养液将阳性杂交瘤细胞依次稀释至 细胞密度为 20个/mL、10个/mL、5个/mL；再将 经过稀释的细胞悬液加入含饲养细胞的 96孔细胞培养板中，每孔 100 μL，每一个密度的细胞加 32个 孔； 每天观察细胞生长情况， 记录各孔细胞生