ICS 65.100.10 CCS G 25 团 体 标 准 T/CTSS 31-2021 灰茶尺蠖病毒 复配剂规模化生产 技术规程 Technical regulations for mass produc tion of Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus compounding agent 中国茶叶学会 2021-07-29 发布 2021-07-30 实施 发 布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020给出的规则起草。 本文件由湖北省农业科学院果树茶叶研究所 提出。 本文件由中国茶叶学 会标准化工作委员会 归口。 本文件起草单位： 湖北省农业科学院果树茶叶研究所。 本文件主要起草人： 谭荣荣、毛迎新、陈娇、陈勋、黄丹娟、王红娟。 全国团体标准信息平台 1 灰茶尺蠖病毒 复配剂规模化生产 技术规程 1 范围 本文件规定 了灰茶尺蠖病毒 复配剂中主要成分灰茶尺蠖病毒规模化生产方式， 主要成分苏云金杆 菌生产工艺及病毒复配剂包装、储运等技术要求。 本文件适用于灰茶尺蠖核型多角体病毒复配剂的规模化生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于 本文件的应用是必不可少的。 其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用 于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 1605 商品农药采样方法 GB 3796 农药包装通则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14825 农药悬浮率测定方法 GB/T 19567.1 苏云金芽孢杆菌原粉 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 灰茶尺蠖核型多角体病毒 Ectropie grisescens Nucleopoly hedrovirus 灰茶尺蠖专性病毒，为不规则的多角体 ，表面呈皱纹状，高低不平。多角体大小不一致，其直径 为0.9 μm～1.6 μm，包埋多个病毒粒子，由蛋白质组成，不溶于水、乙醇、 乙醚、氯仿、苯、 丙 酮、1 mol/L盐酸，溶于 氢氧化钠 、氢氧化钾 、氨及硫酸的水溶液和乙酸。 3.2 复配剂 compounding agent 由一种以上的农药按一定比例混合在一起制成的农药。它可以与杀虫剂、生长素以及农药增效剂 分别相混。 4 病毒规模化生产 4.1 人工饲料的制备 将茶叶粉、桑叶粉、酵母粉、 大豆粉、胆固醇、Vc和Vb按照8:3:3:4:0.1:0.5:0.1 （质量比） 的比例混合均匀 后得到混合物 A备用；将 琼脂1份，纯水 79份混合加热溶解 ，冷却至 50 ℃ ，加入 苯甲酸钠和苯甲酸（质量比 0.33:0.1 ），得到混合物 B；将混合物 A加入混合物 B中搅拌均匀， 放入 模具定型 。 4.2 病毒增殖方式 以感染病毒死亡的典型灰茶尺蠖幼虫尸体为毒源，离心提纯后添食灰茶尺蠖幼虫增殖病毒。 以自制 100孔板为养虫容器，以健康的灰茶尺蠖幼虫为宿主。每孔放人工饲 料0.25 g～0.30 g， 幼虫5头。当灰茶尺蠖幼虫长至 3龄，添加接种病毒的人工饲料 0.25 g～0.30 g，其中病毒 接种浓 度为2×106 PIB/mL，食完后，按照 0.05 g/虫的食量添加新鲜饲料，直至幼虫化蛹。 4.3 病毒提纯 将感染病毒致死的灰茶尺蠖幼虫尸体加适 量无菌水置组织匀浆器皿中匀浆 3 min～5 min，取出 按1:8加无菌水混匀后差速离心 (先500 r/min 低速离心 5 min，弃细胞组织碎片和沉淀，取上清液 再3500 r/min 高速离心 30 min，弃上清液，用无菌水重新悬浮沉淀）。差速离心进行 3次～5次， 直至多角体悬浮液呈乳白色。 全国团体标准信息平台 2 5 苏云金杆菌生产 砂土孢子斜面培 养基30 ℃培养72 h，斜面孢子 31±1 ℃培养12h～15 h，发酵，前期发酵温度 28 ℃～31 ℃，孢子囊明显形成后 ，32℃～33 ℃种子罐发酵 ，20%芽孢晶体脱落时放罐，酸化，浓缩 。 6 病毒复配剂生产工艺 按生产配方单准确称量物料，在剪切机的混合釜 中，依次加入去离子水、助悬剂、润湿剂、分散 剂、病毒、苏云金杆菌，加完物料后继续 剪切30分钟以上 使其充分混匀；将剪切好的原料打入篮式 研磨机中，砂磨 2 h～4 h；取样上激光粒度仪检测，至细度达到 LD50≤20 μm；将研磨好的物料打 入均质釜中进行均质 、熟化。 7 复配剂主要成分测定 7.1 病毒浓度测定 将多角体悬液充分混匀， 取出1 mL，用无菌水按 10倍梯度依次等比稀释 10、102、103、104倍， 混匀，用移液管（枪）吸取配制好的悬液置血球计数板上，静止 2 min～3 min后，置光学显微镜下 观察计数，分 5点取样80小格（即 5个中格），选择适当的稀释浓度（以每个中格中多角体数目不 超过40个为宜）计数多角体，每个血球计数板重复 3次，取其平均值，按公式（ 1）计算多角体含量。 BAC 610480 ………………………… （1） 式中： C―多角体浓度 （PIB/mL）； A―80个小格中多角体的数量 ； B―稀释倍数 。 7.2 苏云金杆菌毒蛋白质量分数的测定 毒素蛋白含量用 SAS-PAGE扫描法进行测定。 苏云金杆菌毒素蛋白质量分数 D按公式（2）计算。 100m 1221vmvD ………………………… （2） 式中： m1 —从标准曲线上查得的样品中毒素蛋白的量（ ug）； m2 —2 mL稀释液中样品的质量（ mg）； v1 — 样品中最终定容体积（ 3.75 mL）； v2 — 注入凝胶上样孔的样品体积 （uL）。 7.3 复配剂悬浮率的测定 取5 mL制剂于100 mL三角玻璃瓶中，加入标准硬 水100 mL，充分振荡混匀后转移至 250 mL具 塞容量瓶中，用标准硬水稀释至 250 mL。充分混匀后取 1 uL试样按照 7.1中的方法对病毒含量进行 测定，取 1 mL按照7.2中的方法对苏云金杆菌毒 素蛋白含量进行测定。 按照GB/T 14825 中的计算式 分别计算复配剂中病毒和苏云金杆菌毒素蛋白的悬浮率。 8 病毒复配剂标志、标签和包装、贮运 8.1 病毒复配悬浮剂的标志、标签和包装应符合 GB 3796的规定。 8.2 常温存放于 通风干燥的库房中。贮运时，严防潮湿和日晒，不得与食物、种子、饲料混合，避 免和皮肤接触，防止人员口鼻吸入。 全国团体标准信息平台 3 附 录 A （规范性） 图A.1 病毒复配剂（茶核·苏悬浮剂）生产工艺流程图 图A.1茶核·苏悬浮剂生产工艺流程图 _________________________________ 病 毒 苏云金杆菌 助 剂 合 格 合 格 不合格 不合格 混 合 砂 磨 再混合 均质熟化 检 测 包 装 成品入库 检 测 全国团体标准信息平台