ICS65.020.30 B43 团体标准 T/SDAA017－2021 噬菌体筛选技术规程 2021－06－22发布 2021－07－23实施 山东省畜牧协会发布TechnicalRegulationsforPhageScreen 全国团体标准信息平台 IT/SDAA017-2021 全国团体标准信息平台 IIT/SDAA017-2021 前言 本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧协会提出并归口。 本文件起草单位：青岛农业大学，山东益生种畜禽股份有限公司，山东鲁丰集团有限公司。 本文件主要起草人：张灿，尹燕博，郭龙宗，刘海燕，李忠晓。 本标准为首次发布。 全国团体标准信息平台 3T/SDAA017-2021 全国团体标准信息平台 4T/SDAA017-2021 噬菌体筛选技术规程 1范围 本文件规定了噬菌体株的生物学特征测定方法及噬菌体株筛选的方法，用于从建立 的噬菌体库中筛选能够裂解目标致病菌的噬菌体。 本文件适用于针对环境中的大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌， 从建立的噬菌体库中筛选适宜的噬菌体株。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本 适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 噬菌体bacteriophage,phage 一类能感染细菌、真菌、藻类、放线菌、支原体及螺旋体等微生物的一类病毒的总称， 亦称细菌病毒。 3.2 噬菌斑plaque 噬菌体侵染细菌，导致宿主细胞溶解死亡，在琼脂培养基生长的菌苔上形成的空斑。 3.3 效价titer 噬菌体的浓度，即每毫升样品含噬菌体的个数。通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑 进行噬菌体的计数，以每毫升中含有的噬菌斑形成单位（PFU/mL）表示其效价。 全国团体标准信息平台 5T/SDAA017-2021 3.4 裂解效率lysisefficiency 在检测的所有细菌菌株中，对噬菌体敏感的细菌所占比例。 4噬菌体生物学活性特征测定 4.1噬菌体样品制备与稀释 取-80℃低温冻存的噬菌体样品100μL，加入带有100μL敏感宿主菌的5mL培养液中， 在37℃条件下培养4h~12h，获得噬菌体增殖液。将噬菌体增殖液置于离心管中，12000 r/min离心15min，取上清液，用0.22μm滤器过滤除菌，获得噬菌体悬液。用无菌生理盐 水依次将噬菌体悬液进行10倍比稀释，获得不同稀释度的噬菌体稀释液。 4.2噬菌体效价测定 按照附录A.4选择3个适宜稀释梯度的噬菌体稀释液样品，每个稀释梯度做三个平行，分 别取100μL，加入至100μL敏感宿主菌的增殖液中，混匀，于37℃条件下孵育5min，加入 5mL上层半固体培养基，混匀后，倾倒在下层固体培养基上，室温静置至上层半固体培养 基凝固。于37℃条件下倒置培养3h~8h。统计单独、均一的噬菌斑个数，按照4.4要求，选 取噬菌斑数量适宜的稀释度平板，根据公式(1)计算每毫升噬菌体原液中的噬菌体数（噬菌 体效价），计算结果取该稀释度下三个平行结果的算术平均值。该试验重复三次，报告结果 取三次噬菌体效价的算术平均值，结果保留2位有效数字。 噬菌体效价（PFU/mL）=噬菌斑数×稀释倍数×10……………………………………. .(1) 4.3噬菌体裂解效率测定 4.3.1宿主菌稀释 选择待稀释的宿主菌，取1mL新鲜制备的宿主菌增殖液，加入9mL生理盐水中，涡旋 混匀，重复上述操作，根据宿主菌增殖液的初始效价直至将宿主菌效价稀释到1×105CFU/mL。 4.3.2裂解效率测定 取1mL待测定的噬菌体样品，加入1mL效价为1×105CFU/mL的宿主菌稀释液中，室温 静置孵育30min，轻轻混匀后用无菌生理盐水将混合液稀释到10-1、10-2、10-3三个梯度，每 个梯度分别取100μL加到宿主菌适宜的固体培养基平板上，用无菌涂布器涂布均匀，每个梯 全国团体标准信息平台 6T/SDAA017-2021 度做三个平行，在37℃条件下倒置培养12h~48h。同时，吸取1mL效价为1×105CFU/mL 的宿主菌稀释液，加入1mL无菌生理盐水作为空白对照处理，重复上述操作步骤。按照GB 4789.2中6.3的规定进行平板上菌落计数，按照公式(2)计算噬菌体的裂解效率。该试验重复 3次，报告结果取平均值。 噬菌体裂解效率（%）=1−处理组菌落数 对照组菌落数×100%.....................................................................(2) 4.4计算要求及允许误差范围 噬菌斑数量根据GB4789.2中6.3规定的菌落计数原则进行计数。从接种后的三个稀释 度中，选择一个适宜的稀释度，进行噬菌斑计数或菌落计数，同一稀释度三个重复的菌数或 噬菌斑数相近。三次重复试验测定结果的绝对差值≤20%，以三次测定结果的算术平均值为 最终测定结果。 5噬菌体株筛选及标准 将待测细菌于37℃条件下震荡培养8h~12h，获得新鲜的细菌增殖液。取1mL细菌增殖 液，加入5mL上层半固体培养基，混匀后，倾倒在下层固体培养基上，室温静置至上层半 固体培养基凝固。用微量移液器分别取噬菌体样品2μL，滴加到双层平板上，室温静置，直 至平板上的噬菌体样品完全吸收。同时，滴加等量的噬菌体样品冻存液（附录A.5）作为空 白对照。在37℃条件下倒置培养12h~48h，形成菌苔，观察菌苔上空斑形成情况。对照无 空斑形成，能够裂解该细菌的噬菌体株能够在菌苔上形成清晰透明的空斑。 全国团体标准信息平台 7T/SDAA017-2021 附录A (资料性) A.1仪器设备 A.1.1恒温培养箱：36℃±1℃ A.1.2离心机：转速12000转 A.1.3超净工作台 A.1.4高压蒸汽灭菌锅 A.1.5恒温震荡培养器：36±1℃~42±1℃ A.1.6电子分析天平：感量0.01g A.1.7电热恒温鼓风干燥箱：10℃~200℃ A.1.8冰箱：-40℃以下和-20℃～8℃ A.1.9无菌培养皿：Φ90mm。 A.1.10微量移液器：0.5μL~10μL、10μL~200μL、100μL~1000μL A.1.11漩涡混合仪 A.1.12细菌涂布器 A.2试剂和材料 A.2.1LB培养基 A.2.2LB固体培养基 A.2.3氢氧化钠 A.2.4盐酸 A.2.5宿主菌（增殖对应的噬菌体） A.3双层琼脂培养基制备 A.3.1上层固体培养基配置： LB固体培养基2.5%（g/100mL） 琼脂粉0.75%（g/100mL） pH值调节到7.2~7.4。 A.3.2下层固体培养基配置： LB固体培养基2.5%（g/100mL） 琼脂粉1.5%（g/100mL） 全国团体标准信息平台 8T/SDAA017-2021 pH值调节到7.2~7.4。 A.3.3液体培养基配置： LB培养基2.5%（g/100mL） 琼脂粉1.5%（g/100mL） pH值调节到7.2~7.4。 A.3.4灭菌 配制的培养基于121℃高压灭菌20min。 除非另有说明，在试验中使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的三级水。 A.4噬菌体稀释梯度的选择 根据保存的噬菌体样品的效价选择噬菌体适宜的稀释梯度。用无菌生理盐水依次将噬菌 体悬液进行10倍比稀释，将噬菌体样本稀释到102PFU/mL~104PFU/mL，选择这三个稀释度 进行噬菌斑计数（图A.4.1），测定噬菌体的效价。 图A.4.1噬菌体在菌苔上形成的噬菌斑 A.5噬菌体冻存液的配置 按照相应宿主菌的培养液各成分比例配置冻存液，含终浓度为30%（v/v）的甘油，121℃ 高压灭菌20min。 全国团体标准信息平台